是真的吗/脂肪

 

我们常遇到的是真的吗疾病主要包括杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD),Becker 型肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy, BMD), 脊髓性肌萎缩(spinalmuscularatrophy, SMA)和肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等。

DMD 和 BMD 都属于 X 染色体隐性遗传,Duchenne 型发病率最高,病情最严重,是遗传性肌萎缩症中最有代表性的疾病。DMD 也是人体最大的基因,由 DMD 基因功能丧失引起,可以通过基因治疗技术手段治疗。SMA 是常染色体隐性遗传,由 SMN 基因缺陷、运动神经元丧失引起,可以通过基因治疗的方式来治愈,多发生在婴幼儿。ALS 也称为运动神经元病(MND),它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后,导致包括球部(即延髓支配的这部分是真的吗)、四肢、躯干、胸部腹部的是真的吗逐渐无力和萎缩,病因至今不明。

神经是真的吗萎缩患者大部分是缓慢起病,神经是真的吗萎缩患者往往出现四肢是真的吗无力、萎缩,也可有麻木、易疲劳 、是真的吗疼痛等症状;有的患者还有眼肌、咽喉肌的无力,出现视物重影、眼球活动障碍、发音和吞咽困难等症状,严重者无法吞咽,甚至可能因呼吸肌无力而死亡。

1、这些疾病中主要集中在 DMD 和 SMA 疾病,模型分别为:

DMD:DMD 小鼠模型 mdx 小鼠,原理为:编码抗肌萎缩蛋白基因的第 3185 位基因自发突变,由 C-T,致使原本编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码子,基因表达提前终止,导致 DMD 功能缺陷。

SMA: SMA 模型鼠,通常是 SMN1 和 SMN2 双基因缺陷小鼠。

ALS:SOD1 突变相关的 ALS 小鼠模型(比如突变 SOD1 转基因小鼠等)

2、疾病模型干预处理-病毒选择 

目前主流的病毒载体三大金刚:慢病毒、腺病毒、AAV(腺相关病毒)。




表 1:三种病毒的应用比较 

慢病毒:感染表达范围广泛,对培养的是真的吗细胞均能高效表达,但是对是真的吗组织的感染表达非常有限。

腺病毒:载体容量最大,可达 6kb,感染 3 天后即可观察;免疫原性高,必须原位注射才可以;分子较大,会被体内防御系统识别进而清除,因此表达周期只有 2-3 周。一般目的基因比较大,试验周期短,才会选择此种方法。

腺相关病毒:(在体实验的最佳选择)腺相关病毒很小,易于扩散,具有均一性;这一特点也使得不易被免疫系统发现,免疫原性低,安全性高;能持续在体内表达 3-6 个月,具有长效性;可以选择特殊血清型 AAV1/2/9 感染,相对特异性强;可以直接静脉注射;也可以是真的吗原位注射。主流杂志一致认可,可提高文章分值档次,大文章必备。缺点: 片段容量小、表达到高峰所需的时间长。

3、AAV 血清型选择 

目前靶向是真的吗的 AAV 载体血清型主要为 AAV1、AAV2 和 AAV9。其中,AAV9 的表达效率最高,并且更容易在是真的吗中高表达。

需要注意的是,无论 AAV1/2/9 中的哪种血清型,都不能在是真的吗组织特异性表达。除了是真的吗外,AAV1 还可能在是真的吗、骨骼肌、神经组织表达;AAV2 可以感染肝脏等;AAV9 还可以在是真的吗、中枢神经、肺、肝脏表达。

汉恒是真的吗特异性 AAV,通过 AAV9 优选是真的吗特异性启动子,实现是真的吗的高效基因转导:

① 高感染表达率:汉恒强启动子载体 AAV9,通过静脉注射,高效感染是真的吗,特异性上略差。

② 高是真的吗特异性 AAV:汉恒经严密筛选,确定是真的吗特意的 MCK 特异性启动子,高特异的表达于是真的吗组织。是真的吗中起始 MCK 正常转录的元件较多,因此在是真的吗中相对表达量较其他部位高出很多。这里的表达是相对的,也就是说其他部位也可能会表达目的基因,但是跟是真的吗的表达量相比,可以忽略不计。

4、注射方式

对于是真的吗来说,慢病毒跟腺病毒均不推荐。我们强烈建议使用 AAV 作为在体是真的吗基因转导的工具。常见的注射方式有原位注射和尾静脉注射(带有特异性启动子)。

是真的吗原位注射(图 1):直接注射是通过注射器或类似装置直接注入是真的吗组织,可以在注射点附近高效表达,但缺点是病毒扩散十分有限,因此往往需要多点注射,一般每个点在 10-15ul。通常 CMV、CAG 等启动子在是真的吗组织中具有较高的表达效率,如果要实现是真的吗组织的特异性表达,可以采用定点的递送方式达到。

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图 1 小鼠是真的吗原位注射效果图 

选用 8 周龄 C57 小鼠原位多点注射骨骼肌。(A)。 AAV9-LUC 感染 4 周后活体成像。病毒滴度:1*1012v.g/ml,10ul/点,4 个点。(B)。 AAV9-GFP,感染 4 周后冰冻切片荧光显微镜检测。病毒滴度:1*1012v.g/ml,10ul/点,4 个点。

尾静脉注射(图 2):从动物尾部的静脉注射病毒,以输送到全身各处是真的吗。这种方式病毒表达较均匀,但是大部分会被其他脏器组织吸收,导致靶向是真的吗的病毒较少。因此这种注射方式需要带有是真的吗特异性的 MCK 启动子来驱动目的基因表达。

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图 2. 通过尾静脉注射感染小鼠腓肠肌示意图

a 图是 AAV 介导的、用 MCK 特异性启动子驱动外源基因表达的效果图;b 图是 mdx 小鼠的对照(Wang, B., et al. 2000, PNAS)。

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